PCR, on polymeraasiketjureaktio, joka viittaa dNTP:n, Mg2+:n, elongaatiotekijöiden ja amplifikaatiota lisäävien tekijöiden lisäämiseen järjestelmään DNA-polymeraasin katalyysin alaisena käyttämällä emo-DNA:ta templaattina ja spesifisiä alukkeita pidentämisen lähtökohtana. Denaturaation, pariutumisen, pidentämisen jne. vaiheiden kautta emäjuosteen templaatti-DNA:lle komplementaarisen tytärjuosteen DNA:n replikaatioprosessi in vitro voi nopeasti ja spesifisesti monistaa minkä tahansa kohde-DNA:n in vitro.
1. Hot Start PCR
Monistuksen aloitusaika tavanomaisessa PCR:ssä ei ole se, että PCR-konetta laitetaan PCR-koneeseen, ja sitten ohjelma alkaa monistua.Kun järjestelmän konfigurointi on valmis, vahvistus alkaa, mikä voi aiheuttaa epäspesifistä vahvistusta, ja hot-start PCR voi ratkaista tämän ongelman.
Mikä on hot start PCR?Kun reaktiosysteemi on valmistettu, entsyymimodifiointiaine vapautuu korkeassa lämpötilassa (yleensä yli 90°C) reaktion alkulämmitysvaiheessa eli "hot start" -vaiheessa, jolloin DNA-polymeraasi aktivoituu.Tarkka aktivointiaika ja lämpötila riippuvat DNA-polymeraasin ja kuumakäynnistysmuuntimen luonteesta.Tämä menetelmä käyttää pääasiassa modifioijia, kuten vasta-aineita, affiniteettiligandeja tai kemiallisia modifioijia DNA-polymeraasin aktiivisuuden estämiseen.Koska DNA-polymeraasin aktiivisuus estyy huoneenlämpötilassa, kuumakäynnistystekniikka tarjoaa suuren mukavuuden useiden PCR-reaktiojärjestelmien valmistukseen huoneenlämpötilassa tinkimättä PCR-reaktioiden spesifisyydestä.
2. RT-PCR
RT-PCR (käänteistranskriptio-PCR) on kokeellinen tekniikka käänteistranskriptioon mRNA:sta cDNA:ksi ja sen käyttämiseksi templaattina monistukseen.Kokeellinen menetelmä on uuttaa ensin kudoksissa tai soluissa oleva kokonais-RNA, käyttää Oligoa (dT) alukkeena, käyttää käänteiskopioijaentsyymiä cDNA:n syntetisoimiseen ja käyttää sitten cDNA:ta templaattina PCR-monistuksessa kohdegeenin saamiseksi tai geenin ilmentymisen havaitsemiseksi.
3. Fluoresoiva kvantitatiivinen PCR
Fluoresoiva kvantitatiivinen PCR (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) viittaa menetelmään lisätä fluoresoivia ryhmiä PCR-reaktiojärjestelmään, käyttämällä fluoresoivien signaalien kerääntymistä koko PCR-prosessin seuraamiseen reaaliajassa ja lopuksi käyttämällä standardikäyrää templaatin kvantitatiiviseen analysointiin.Yleisesti käytettyjä qPCR-menetelmiä ovat SYBR Green I ja TaqMan.
4. Sisäkkäinen PCR
Sisäkkäinen PCR viittaa kahden PCR-alukesarjan käyttöön kahdessa PCR-monistuskierroksessa, ja toisen kierroksen monistustuote on kohdegeenifragmentti.
Jos ensimmäisen alukeparin (ulommat alukkeet) yhteensopimattomuus aiheuttaa epäspesifisen tuotteen monistumisen, mahdollisuus, että toinen alukepari tunnistaa saman epäspesifisen alueen ja jatkaa monistumista, on hyvin pieni, joten amplifikaatio toisella alukeparilla, PCR:n spesifisyys on parantunut.Yksi etu kahden PCR-kierroksen suorittamisesta on, että se auttaa monistamaan riittävästi tuotetta rajoitetusta lähtö-DNA:sta.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR on menetelmä PCR-reaktion spesifisyyden parantamiseksi säätämällä PCR-syklin parametreja.
Touchdown PCR:ssä muutaman ensimmäisen syklin pariutumislämpötila asetetaan muutaman asteen alukkeiden maksimipariutumislämpötilan (Tm) yläpuolelle.Korkeampi pariutumislämpötila voi tehokkaasti vähentää epäspesifistä monistumista, mutta samaan aikaan korkeampi pariutumislämpötila pahentaa alukkeiden ja kohdesekvenssien erottamista, mikä johtaa alentuneeseen PCR-saantoon.Siksi muutaman ensimmäisen syklin aikana pariutumislämpötila asetetaan yleensä laskemaan 1 °C sykliä kohden kohdegeenin sisällön lisäämiseksi järjestelmässä.Kun hehkutuslämpötila lasketaan optimilämpötilaan, hehkutuslämpötilaa ylläpidetään jäljellä olevien jaksojen ajan.
6. Suora PCR
Suora PCR viittaa kohde-DNA:n monistamiseen suoraan näytteestä ilman nukleiinihapon eristämistä ja puhdistusta.
Suoraa PCR:ää on kahta tyyppiä:
suora menetelmä: ota pieni määrä näytettä ja lisää se suoraan PCR Master Mixiin PCR-tunnistusta varten;
krakkausmenetelmä: näytteen ottamisen jälkeen lisää se lysaattiin, lysoi vapauttaaksesi genomi, ota pieni määrä lyysattua supernatanttia ja lisää se PCR Master Mixiin, suorita PCR-tunnistus.Tämä lähestymistapa yksinkertaistaa kokeellista työnkulkua, vähentää käytännön aikaa ja välttää DNA:n häviämisen puhdistusvaiheiden aikana.
7. SOE PCR
Geenisilmukointi limittäin laajennus-PCR:llä (SOE PCR) käyttää alukkeita, joissa on komplementaariset päät, jotta PCR-tuotteet muodostavat päällekkäisiä ketjuja, niin että myöhemmässä monistusreaktiossa päällekkäisten ketjujen pidentämisen kautta saadaan erilaisia A-tekniikan lähteitä, joissa monistetut fragmentit limittyvät. ja liimattu yhteen.Tällä tekniikalla on tällä hetkellä kaksi pääsovellussuuntaa: fuusiogeenien rakentaminen;geenikohtainen mutaatio.
8. IPCR
Käänteinen PCR (IPCR) käyttää käänteisiä komplementaarisia alukkeita monistaakseen muita DNA-fragmentteja kuin kahta aluketta ja monistaa tuntemattomia sekvenssejä tunnetun DNA-fragmentin molemmilta puolilta.
IPCR suunniteltiin alun perin määrittämään vierekkäisten tuntemattomien alueiden sekvenssi, ja sitä käytetään enimmäkseen geenipromoottorisekvenssien tutkimiseen;onkogeeniset kromosomaaliset uudelleenjärjestelyt, kuten geenifuusio, translokaatio ja transpositio;ja virusgeeniintegraatio, ovat myös yleisesti käytössä nyt Kohdennettua mutageneesiä varten kopioi plasmidi, jossa on haluttu mutaatio.
9. dPCR
Digitaalinen PCR (dPCR) on tekniikka nukleiinihappomolekyylien absoluuttiseen kvantifiointiin.
Nukleiinihappomolekyylien kvantifiointiin on tällä hetkellä kolme menetelmää.Fotometria perustuu nukleiinihappomolekyylien absorbanssiin;reaaliaikainen fluoresoiva kvantitatiivinen PCR (Real Time PCR) perustuu Ct-arvoon, ja Ct-arvo viittaa syklin numeroon, joka vastaa havaittavissa olevaa fluoresenssiarvoa;digitaalinen PCR on uusin kvantitatiivinen teknologia, joka perustuu yksimolekyyliseen PCR-menetelmä nukleiinihappojen laskemiseen.
Postitusaika: 13.6.2023