Ultrasuodatussentrifugiputken käyttö ja varotoimet
1) Valitse sopiva ultrasuodatusputki.Huomaa, että UF-kalvojen sietokyky eri kemikaaleja kohtaan eroaa toisistaan.Tyypillisesti ultrasuodatusputket, joiden molekyylipainoraja on 10 kDa, voidaan valita molekyylipainoraja-arvolla, joka ei saisi olla suurempi kuin 1/3 kiinnostavan proteiinin molekyylipainosta, kuten 35 kDa.Jos kiinnostavan proteiinin molekyylipaino on noin 10 kd, voidaan käyttää ultrasuodatusputkea, jonka molekyylipainoraja on 3 KD.
(2) Äskettäin ostettu ultrasuodatus on kuiva, siihen on lisätty ennen käyttöä ultrapuhdasta vettä ja vesi on kulkenut kokonaan kalvon, jäähauteen tai jääkaapin läpi esijäähdytettynä muutaman minuutin ajan.Sitten vesi kaadetaan pois, eli proteiinineste, ja kuinka paljon lisätään, sen mukaan, kumpi on enintään putken yläosassa oleva valkoinen viiva.Toiminta on kevyttä, ja ultrasuodatusputki on esijäähdytettävä jäillä ennen proteiiniliuoksen lisäämistä.
3) Sekä massan että painopisteen oli määrä saavuttaa tasapaino.Huomaa, että pyörimisnopeus ja kiihtyvyys eivät ole kovin nopeita, muuten vaurioittavat suoraan ultrasuodatuskalvoa.Keskipakoultrasuodatus aloitettiin (sentrifugi esijäähdytetty 4 asteeseen).Kun eri sentrifugien kierrosluku muutettiin g:ksi, se oli erilainen.Sentrifugin kiihtyvyys säädettiin minimiin, mikä pienensi kalvoon kohdistuvaa painetta.Huomaa, että poistu sentrifugista sen jälkeen, kun sentrifugi on saavuttanut määränpään nopeuden, tai jos sinulla on ongelma, et voi käsitellä sitä ensimmäistä kertaa.Kalvon suuntaus karaan säädettiin ohjeiden mukaan (kulmikas sentrifugikotelo on kalvo akseliin nähden kohtisuorassa).Käytännössä yleinen pyörimisnopeus on pienempi kuin ohjeessa, joten sentrifugiputken käyttöikää voidaan pidentää.
3) Sekä massan että painopisteen oli määrä saavuttaa tasapaino.Huomaa, että pyörimisnopeus ja kiihtyvyys eivät ole kovin nopeita, muuten vaurioittavat suoraan ultrasuodatuskalvoa.Keskipakoultrasuodatus aloitettiin (sentrifugi esijäähdytetty 4 asteeseen).Kun eri sentrifugien kierrosluku muutettiin g:ksi, se oli erilainen.Sentrifugin kiihtyvyys säädettiin minimiin, mikä pienensi kalvoon kohdistuvaa painetta.Huomaa, että poistu sentrifugista sen jälkeen, kun sentrifugi on saavuttanut määränpään nopeuden, tai jos sinulla on ongelma, et voi käsitellä sitä ensimmäistä kertaa.Kalvon suuntaus karaan säädettiin ohjeiden mukaan (kulmikas sentrifugikotelo on kalvo akseliin nähden kohtisuorassa).Käytännössä yleinen pyörimisnopeus on pienempi kuin ohjeessa, joten sentrifugiputken käyttöikää voidaan pidentää.
(4) Kun väkevöidään jäljellä olevaan 1 ml:aan, ota 50 ul puskuriliuosta, lisää 10 ul läpivirtausta ja katso, onko sinistä väriä, arvioidaksesi, puuttuuko ultrasuodatusputkesta proteiinia.Jos putki vuotaa, kaada ylempi kerros uudelleen ja virtaa läpi uuteen putkeen ultrasuodatuksen aloittamiseksi.Määrittääksesi tarkalleen, puuttuiko putkia, sentrifugoi 10 minuuttia 5 mg:lla BSA:ta ennen läpivirtausta, proteiiniliimalla ajoa tai Bradfordin raakakoetta ja jatka lisäämällä jäljellä oleva väkevä proteiiniliuos (joka toimii jäällä ja estää proteiinien kuumenemisen), kunnes kaikki tiiviste on lisätty.Ole varovainen sentrifugoinnin aikana, jos proteiinit saostuvat, mikä johtaa putken sulkeutumiseen.Jos saostumista tapahtuu, määritä, onko saostumisen erityinen syy liiallinen proteiinipitoisuus vai sopimaton puskuri;Edellinen voidaan ratkaista ultrasuodattamalla useita ultrasuodatusputkia samanaikaisesti alentamalla pitoisuutta ja jälkimmäinen vaihtamalla erilaisia puskuriliuoksia, kunnes proteiinia ei saostu.
(4) Kun väkevöidään jäljellä olevaan 1 ml:aan, ota 50 ul puskuriliuosta, lisää 10 ul läpivirtausta ja katso, onko sinistä väriä, arvioidaksesi, puuttuuko ultrasuodatusputkesta proteiinia.Jos putki vuotaa, kaada ylempi kerros uudelleen ja virtaa läpi uuteen putkeen ultrasuodatuksen aloittamiseksi.Määrittääksesi tarkalleen, puuttuiko putkia, sentrifugoi 10 minuuttia 5 mg:lla BSA:ta ennen läpivirtausta, proteiiniliimalla ajoa tai Bradfordin raakakoetta ja jatka lisäämällä jäljellä oleva väkevä proteiiniliuos (joka toimii jäällä ja estää proteiinien kuumenemisen), kunnes kaikki tiiviste on lisätty.Ole varovainen sentrifugoinnin aikana, jos proteiinit saostuvat, mikä johtaa putken sulkeutumiseen.Jos saostumista tapahtuu, määritä, onko saostumisen erityinen syy liiallinen proteiinipitoisuus vai sopimaton puskuri;Edellinen voidaan ratkaista ultrasuodattamalla useita ultrasuodatusputkia samanaikaisesti alentamalla pitoisuutta ja jälkimmäinen vaihtamalla erilaisia puskuriliuoksia, kunnes proteiinia ei saostu.
(5) Ensimmäisiä vaiheita käytetään proteiinin väkevöimiseen, ja jos puskuria on vaihdettava, lisää varovasti uutta puskuria (ultrasuodatus 0,22 um:n ultrasuodatuskalvon läpi) noin 1 ml:aan kokonaisproteiinia ja väkevöi uudelleen noin 1 ml:ksi kolmeksi ajaksi. peräkkäisiä kertoja, jolloin lopullinen konsentroitu lopullinen tilavuus riippuu halutusta proteiinipitoisuudesta, yleensä enintään 500 ul, mutta myös 200 ul:n tarkkuudella.Saavuta 1000 × tai enemmän kolmella kerralla, olennaisesti yhtä paljon puskurin muutosta, joka on laskettu vähintään 10-kertaisella tilavuuden rikastamisella joka kerta.
(5) Ensimmäisiä vaiheita käytetään proteiinin väkevöimiseen, ja jos puskuria on vaihdettava, lisää varovasti uutta puskuria (ultrasuodatus 0,22 um:n ultrasuodatuskalvon läpi) noin 1 ml:aan kokonaisproteiinia ja väkevöi uudelleen noin 1 ml:ksi kolmeksi ajaksi. peräkkäisiä kertoja, jolloin lopullinen konsentroitu lopullinen tilavuus riippuu halutusta proteiinipitoisuudesta, yleensä enintään 500 ul, mutta myös 200 ul:n tarkkuudella.Saavuta 1000 × tai enemmän kolmella kerralla, olennaisesti yhtä paljon puskurin muutosta, joka on laskettu vähintään 10-kertaisella tilavuuden rikastamisella joka kerta.
Postitusaika: 09.11.2022